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Optimisation des machines PCR en temps réel pratiques

Nombre Parcourir:0     auteur:Éditeur du site     publier Temps: 2021-11-24      origine:Propulsé

Optimisation des machines PCR en temps réel pratiques

S'il s'agit d'une PCR quantitative de fluorescence en temps réel pour la quantification du virus et le génotypage du SNP, nous avons besoin d'une machine PCR avec la spécificité la plus élevée possible; Si c'est une détection d'agent pathogène et d'ARNm, nous avons besoin de sensibilité élevéeMachine à pcr, alors comment devrions-nous optimiser cette machine PCR?

Voici la liste de contenu:

l Amélioration de l'efficacité de l'amplification de la machine PCR

l Utilisation des amorces de machine PCR en temps réel pour PCR générale

Améliorer l'efficacité de l'amplification de la machine PCR

Améliorerla machine PCREfficacité d'amplification, spécificité et sensibilité, nous pouvons optimiser la machine PCR quantitative de fluorescence en temps réel pour l'expérience à travers une série de mesures. Le premier est la sélection de la séquence cible.

1, le choix de la séquence de la machine PCR de la machine PCR en temps réel pratique de la longueur appropriée comprise entre 50 et 150 pb. Des séquences plus courtes prennent moins de temps pour synthétiser et avoir des délais d'amplification plus courts, la possibilité de contaminer l'ADN étant amplifié est réduite.

2, Lors de la sélection de la séquence cible, utilisez la recherche d'explosion pour analyser la séquence cible pour les polymorphismes et les erreurs de séquençage et évitez-les. S'il existe des séquences en double dans la séquence cible, elle réduira la sensibilité de détection de cette machine PCR et doit également être évitée.

3, contrôlez la teneur en GC ≤ 60% dans la séquence cible. La teneur élevée en GC affectera la dénaturation de la séquence cible du cycle thermique, mais également facile à produire cette amplification non spécifique de la machine PCR.

4, éviter de générer une structure secondaire. Les séquences cibles avec des séquences répétitives inverse sont faciles à produire une structure secondaire, ce qui affecte l'hybridation des amorces et des sondes de machine PCR en temps réel pratiques.

En outre, nous devons également veiller à ce que la qualité du modèle n'affectera pas l'amplification, les résultats de la machine PCR actuelle en temps réel ont une fiabilité. Par exemple, l'ADN endommagé ne peut pas être amplifié de manière adéquate dans la machine PCR ou non amplifié du tout. De plus, la présence d'ADN polymérase inhibition des réactifs (DMSO, etc.) et de contaminants (SDS, etc.) dans le modèle peut affecter la fiabilité des résultats d'amplification de la machine PCR.

Utilisation des amorces de machine PCR en temps réel pour PCR général

Obtenir pratique en temps réelMachine à pcrAmorces, cette méthode peut également être utilisée pour la PCR ordinaire.

1, la longueur doit être de 18-30 pb pour assurer la spécificité de la liaison.

2, la température de fusion (valeur TM) doit être de 55 à 60 ° C, et les valeurs TM des deux amorces doivent différer de 2 à 3 ° C.

3, chaque amorce doit avoir 1 à 3 guanines ou cytosines à l'extrémité 3 ', ce qui peut facilement réduire l'amplification non spécifique lors de la machine PCR en temps réel. Plus de 3 feront feu à faire feu et provoqueront un \"Effet coulissant \" menant à la mauvaise extension.

4. La teneur en GC des amorces doit être d'environ 50%, une teneur en GC trop élevée augmentera la valeur TM.

5, les amorces de la machine PCR doivent éviter les séquences répétitives inverse, car elles formeront une structure secondaire, affectant la liaison à l'amorce sur le modèle.

6, s'il s'agit de RT-PCR, vous devez également éviter de concevoir des amorces pour se lier sur des séquences d'exon, ce qui entraînera des résultats expérimentaux de la machine PCR faussement positive. L'approche correcte doit être conçue sur le flanc d'intron long, ou des introns courts, ou sur la région de la jonction Exon-Exon.

7. Désaltion et purification des amorces.

Notez que parfois, lorsque vous avez fait tous les points, les amorces peuvent ne pas amplifier, de sorte que vous devriez redéfinir les amorces.

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